慢病毒介导hTERTp-TK与hTERTp-tumstatin联合对HepG2细胞的抑制作用

摘要：目的 观察重组慢病毒Lv-hTERTp-TK与Lv-hTERTp-tumstatin在肝癌HepG2细胞中的靶向表达,探讨二者联合在体内外对HepG2细胞的抑制作用. 方法 用不同MOI重组慢病毒Lv-hTERTp-TK、 Lv-hTERTp-tumstatin转染肝癌细胞HepG2、正常肝细胞L02,72 h后荧光显微镜观察转染情况;逆转录PCR检测TK、 tumstatin mRNA在HepG2、 L02细胞中的表达;四甲基偶氮唑蓝法观察两种细胞增殖情况;流式细胞术检测两种细胞凋亡情况;RT-PCR、 Western blot检测HepG2细胞bcl-2、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA和蛋白的表达;将HepG2细胞接种于30只BALB/c裸鼠皮下,构建动物移植瘤模型,随机分为5组,空白对照组、空载体组、tumstatm组、TK组及联合组,每组6只,瘤内分别注射磷酸盐缓冲溶液、空载体慢病毒Lv-hTERTp-eGFP、重组慢病毒Lv-hTERTp-tumstatin、重组慢病毒Lv-hTERTp-TK和重组慢病毒Lv-hTERTp-tumstatin+Lv-hTERTp-TK;4周后处死裸鼠,观察各组移植瘤体积及质量的变化;行HE染色进行各组肿瘤组织及主要脏器的形态学观察;免疫组织化学法检测肿瘤内微血管密度;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率.数据采用方差分析. 结果 转染后TK、 tumstatin基因在HepG2细胞中特异表达,在L02细胞中无表达.TK组、tumstatin组及联合组均对HepG2细胞生长有抑制作用,联合组抑制率明显高于单基因作用组(F=731.679,P＜0.05),各组L02细胞抑制率差异无统计学意义(F=0.774,P＞0.05);联合组HepG2细胞总凋亡率达72.61％±3.29％,明显高于TK组(53.63％±3.06％)、tumstatin组(45.13％±2.15％)、空白对照组(13.29％±1.15％)(F=365.022,P＜0.05),各组L02细胞凋亡率差异无统计学意义(F=0.391,P＞0.05);与对照组相比,实验组HepG2细胞bcl-2及VEGF表达水平均下降(bcl-2 mRNA:F=322.780,P＜0.05;VEGF mRNA:F=561.136,P＜0.05;bcl-2蛋白:F=34.203,P＜0.05;VEGF蛋白:F=32.988,P＜0.05),其中联合组bcl-2及VEGF表达水平均低于单基因组(P值均＜0.05).tumstatin组、TK组和联合组的抑瘤率分别为40.68％、 44.96％和72.09％,联合组抑瘤效果显著(P＜0.05);HE染色显示联合组肿瘤细胞凋亡明显.与空白对照组相比,其他各组裸鼠体内肝、脾和肾等主要脏器组织形态学均无显著变化;空白对照组、空载体组、TK组、tumstatin组和联合组的微血管密度分别为28.4±4.28、29.2±2.59、20.8±3.35、 14.2±4.87、5.8±2.77,tumstatin组抗肿瘤血管生成作用强于TK组(P＜0.05),且联合组作用明显(P＜0.05).联合组肿瘤细胞凋亡率为70.11％±5.67％,明显高于tumstatin组(23.75％±5.21％)、TK组(48.30％±4.99％)、空白对照组(3.89％±1.13％)(P＜0.05),其中TK组的促凋亡作用较tumstatin组显著(P＜0.05). 结论 hTERT启动子驱动TK、 tumstatin在HepG2细胞中靶向表达,两种基因联合在体内外显著抑制HepG2细胞增殖和促进HepG2细胞凋亡,作用明显强于单基因,其机制可能与bcl-2及VEGF表达下调有关.