过氧化物酶体增殖物激活受体α抗炎作用的细胞与分子机制研究

摘要：目的 研究过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)抗炎作用的细胞与分子机制.方法 第一部分将小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞(BMDMs)按随机数字表法随机分为对照组、脂多糖(LPS)组、PPARα的选择性激动剂WY14643 10 μ mol/L组、WY14643 25 μmol/L组、WY14643 50 μmol/L组;第二部分将BMDMs按随机数字表法随机分为LPS组、WY14643+ LPS组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+WY14643+ LPS组.通过LPS (20 ng/ml)刺激BMDMs构建细胞炎症模型,WY14643作为PPAR α的选择性激动剂于造模前2h分别按10μmol/L、25 μ mol/L、50μmol/L给药(第二部分研究以50 μ mol/L给药),3-MA作为自噬抑制剂于造模前2h以10 mmol/L给药,对照组给予等量的二甲基亚砜,绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3质粒于造模前24h转染细胞,于LPS刺激后6h收取细胞行相关的检测.荧光显微镜下通过检测绿色荧光蛋白的多少来评价自噬活性的高低;实时定量PCR检测促炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)-1 β、IL-6以及趋化因子(CXCL)-1、CXCL-10的mRNA表达;蛋白质印迹法检测PPAR α,自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3 (LC3)、自噬相关基因(ATG)-5、ATG-7、溶酶体相关膜蛋白-1的表达.组间差异采用单因素方差分析,各组之间差异的两两比较用LSD-t检验. 结果 在体外,PPARα活化抑制了LPS诱导的原代巨噬细胞炎症反应,且呈剂量依赖性:在对照组、LPS组、WY1464310 μ mol/L组、WY14643 25 μmol/L组、WY14643 50μmol/L组基因表达结果显示,TNF α的相对表达量分别为0.085±0.009、4.065±0.544、3.281±0.368、1.780±0.293、0.781±0.303,F=45.595,P＜0.01;IL-1 β的相对表达量分别为0.081±0.017、0.776±0.303、0.225±0.154、0.161±0.068、0.101±0.025,F=6.897,P＜0.05;IL-6的相对表达量分别为0.041 ±0.011、0.189±0.014、0.144±0.033、0.126±0.013、0.048士0.015,F=23.371,P＜0.01;CXCL-1的相对表达量分别为0.051±0.011、0.515±0.145、0.356±0.078、0.257±0.068、0.069±0.030,F=11.742,P＜0.01;CXCL-10的相对表达量分别为0.126±0.068、0.831±0.093、0.508±0.245、0.474±0.047、0.204±0.021,F=10.266,P＜0.05.在体外,PPAR α活化促进了细胞自噬,且呈剂量依赖性:在对照组、LPS组、WY14643 10μmol/L组、WY14643 25μmol/L组、WY1464350μmol/L组蛋白质印迹及荧光显微镜观察结果显示,随着WY14643干预浓度的增加,自噬相关蛋白的表达及自噬小体的形成逐渐增多.在体外,抑制细胞自噬后加剧了原代巨噬细胞的炎症反应,逆转了PPARα的原有抗炎作用:在LPS组、WY14643+LPS组、3-MA+WY 14643+LPS组基因表达结果显示,TNFα的相对表达量分别为4.327±0.478、1.218±0.424、3.901±0.447,F=28.064,P＜0.05;IL-1 β的相对表达量分别为4.277±0.407、1.418±0.424、3.029±0.192,F=32.279,P＜0.01;IL-6的相对表达量分别为4.175±0.549、1.373±0.499、4.031 ±0.475,F=19.213,P＜0.05;CXCL-1的相对表达量分别为8.199±1.149、2.024±0.547、5.973±0.843,F=25.178,P＜0.05;CXCL-10的相对表达量分别为1.208±0.148、0.206±0.069、0.798±0.170,F=27.514,P＜ 0.05.结论 PPAR α可通过促进细胞自噬抑制炎症反应,PPARα可能成为临床上防治炎症性疾病的一个新的靶点.